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Neurofilament M Rabbit pAb | Cat.# AYP17616 | 艾博立生物
Neurofilament M Rabbit pAb (货号:AYP17616)
宿主: Rabbit 克隆性: Polyclonal 反应: Human,Mouse,Rat WB IHC IF/ICC
Western blot analysis of Neurofilament M expressed in SH-SY5Y using Neurofilament M Rabbit pAb at 1:1000. Secondary antibody: HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) at 1:5000. Lysates/proteins: 30ug per lane. Blocking buffer: 5% non-fat dry milk in TBST. Detection: ECL Enhanced Kit. Exposure time: 120s.
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Western blot - Neurofilament M Rabbit pAb
Western blot analysis of Neurofilament M expressed in SH-SY5Y using Neurofilament M Rabbit pAb at 1:1000. Secondary antibody: HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) at 1:5000. Lysates/proteins: 30ug per lane. Blocking buffer: 5% non-fat dry milk in TBST. Detection: ECL Enhanced Kit. Exposure time: 120s.
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货号：AYP17616
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销售条款
反应
Human,Mouse,Rat
宿主
Rabbit
克隆性
Polyclonal
应用
WB IHC IF/ICC
推荐浓度
WB: 1:500 - 1:2000 IHC: 1:50 - 1:200 IF/ICC: 1:50 - 1:200
理论分子量
59kDa/102kDa
实测分子量
160KDa
形式
Liquid
保存条件
Store at -20℃. Avoid freeze / thaw cycles.
偶联物
Unconjugated
阳性对照
SH-SY5Y
细胞定位
axon,cytoplasm,intermediate filament cytoskeleton,neurofilament,postsynaptic intermediate filament cytoskeleton
纯化
Affinity purification
抗原信息
抗原信息
Recombinant fusion protein containing a sequence corresponding to amino acids 100-260 of human Neurofilament M (NP_005373.2).
序列
查看序列
NEKEQLQGLNDRFAGYIEKVHYLEQQNKEIEAEIQALRQKQASHAQLGDAYDQEIRELRATLEMVNHEKAQVQLDSDHLEEDIHRLKERFEEEARLRDDTEAAIRALRKDIEEASLVKVELDKKVQSLQDEVAFLRSNHEEEVADLLAQIQASHITVERKD
靶点信息
研究背景
Neurofilaments are type IV intermediate filament heteropolymers composed of light, medium, and heavy chains. Neurofilaments comprise the axoskeleton and functionally maintain neuronal caliber. They may also play a role in intracellular transport to axons and dendrites. This gene encodes the medium neurofilament protein. This protein is commonly used as a biomarker of neuronal damage. Alternative splicing results in multiple transcript variants encoding distinct isoforms.
基因 ID
4741
基因名
NEFM
Swiss
P07197
别名
NEF3;NF-M;NFM;NEFM
功能
Neurofilaments usually contain three intermediate filament proteins: L, M, and H which are involved in the maintenance of neuronal caliber.
研究领域
实验步骤
一、实验试剂及耗材
a. RIPA 裂解液
b. 蛋白酶抑制剂
c. BCA工作液
d. BSA Standard Solution(5mg/ml)
e. 1×PBS缓冲液
f. 5×loading buffer
a．30% Acr-Bis (29:1)
b．1 M Tris-HCl (pH6.8)
C．1.5M Tris-HCl (pH8.8)
d．10%SDS
e．10%Ammonium persulfate (APS)
f．TEMED
a. 1X Tris-Glycine SDS Running Buffer
b. 1X Western Transfer Buffer
c. Filter Paper (7.5×10cm)
d. Nitrocellulose membrane
a. 1XTBST Buffer
b. 1X Western Blocking Buffer
c. Skimmed milk powder
d. Bovine Serum Albumin (BSA)
e. Western Antibody Dilution Buffer
f. HRP 偶联二抗（AS014/AS003）
g. SignalFire™ ECL Reagent
二、实验步骤
（1）细胞收集
a. 贴壁培养细胞收集
b. 悬浮培养细胞收集
c. 组织样本收集
（2）总蛋白提取
a. 细胞/组织裂解7 个细胞(1个T75培养瓶细胞量)的比例加入相应体积的裂解液（细胞量足够时都加入3mL，不足时根据细胞量计算），裂解20min，每隔5min将离心管置于涡旋振荡仪上震荡10s。组织碎片按照0.5mL 裂解液/100mg组织向匀浆器中加入蛋白裂解液，每3min研磨一次，重复5次，使组织尽量碾碎。（裂解液中根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂）。
b. 离心
c. 蛋白变性
（3）蛋白浓度测定（BCA法）
a. BCA工作液的配置
b. 标准品测定
（1）制胶器安装
（2）分离胶制备
根据不同蛋白大小，选择不同浓度的分离胶（见附件表）。将制备好的胶溶液注入预先安装好的制胶器中，加入异丙醇封胶。室温水平放置30min左右。注意防止胶溶液产生气泡并注入制胶器中；注胶前再加入TEMED，防止注胶前凝固；注入异丙醇时需沿玻板一边缓慢拖动加入。
（3）浓缩胶制备
分离胶凝固后，沿玻板一边倒出异丙醇，并用滤纸吸干。再根据需要的体积制备浓缩胶（见附表）。将制备好的胶溶液注入制胶器中，并把准备好的样品梳沿玻板一端缓慢插入胶溶液中，室温水平放置20-30min。注意样品梳与胶溶液之间避免气泡产生。
（4）上样
待浓缩胶凝固好后，双手垂直拔出样品梳，并用Tris-Glycine SDS Running Buffer注入到内外槽中，形成闭合回路。用移液器吸取样品垂直梳孔上样，蛋白含量25ug/孔。注意内槽Tris-Glycine SDS Running Buffer需注满，外槽Tris-Glycine SDS Running Buffer没过底部3~5cm即可。
（5）电泳
上样完以后，连通电泳仪电源，注意正负极需连接正确，设定适宜的电泳参数，浓缩胶电泳参数为恒压80V，待样本进入分离胶是，可将电泳调至120V。当溴酚蓝电泳到凝胶底部时，停止电泳，关闭电泳仪电源，或根据目的蛋白分子量大小参照Marker电泳情况延长电泳时间。
（1）准备工作
a. Western Transfer Buffer至少提前2h （即开始电泳后）放入-20℃冰箱预冷，但注意避免结冰。
b. 根据胶体大小,将Filter Paper及Nitrocellulose membrane剪裁至合适尺寸。
c. 目的蛋白＞20KD选择0.45μm NC膜/PVDF膜；目的蛋白＜20KD选择0.2μmNC膜或PVDF膜，选择完毕后将NC膜放在Western Transfer Buffer中浸泡备用，注意如使用的是PVDF膜需先放入甲醇中浸泡5-10min，再放入Western Transfer Buffer中浸泡备用。
（2）转膜
取出玻板中的凝胶，在夹板上依次放一块多孔垫、三张滤纸、凝胶、膜、三张滤纸、一块多孔垫（“三明治”结构），将转好的膜放在转膜槽，按一定的条件进行转膜。（见附表）
将膜从“三明治”结构中取出，放入合适的抗体孵育槽中，加入Western Blocking Buffer室温孵育1h，一张6.3×8.3cm大小的膜加入6~7ml即可。
a. 将一抗用1X Western Blocking Buffer/1XTBST Buffer按照合适比例进行稀释。
b. 封闭结束后，将稀释好的一抗工作液倒入孵育槽中，室温2h或4℃过夜。
一抗孵育结束后，加入TBST Buffer洗涤4次，5min/次。
a. 一抗洗涤结束前10min，将二抗用1XTBST Buffer按照合适比例进行稀释。
b. 洗涤结束后，将稀释好的二抗工作液加入孵育槽中，室温1h。
二抗孵育结束后，加入TBST Buffer洗涤4次，5min/次。
a. 根据膜的大小，按每 10cm2 膜使用 1-2ml 工作液，按比例吸取等体积的 SolutionⅠ和 SolutionⅡ混匀，配制成发光检测工作液。
b. 用平头镊子将膜取出，膜的下缘轻轻接触吸水纸，去除膜上多余的液体。用移液器将工作液加到转印膜上，使其均匀覆盖，室温孵育 1-2min，此步骤可在洁净保鲜膜上或塑料盒中完成。
c. 压片检测：将膜固定于片夹内。暗室内压片 1 分钟，立即显影定影，根据结果再调整压片时间。或直接分别压片 30s、60s、90s、180s，然后一起显影定影观察结果。
d. 荧光成像仪检测：将膜放置到荧光成像仪内，参考仪器说明书进行检测。
一、实验仪器及试剂
微波炉、4℃冰箱、恒温恒湿箱、烘箱、光学显微镜、移液器、孵育湿盒、抗原修复盒。
(1) 缓冲液：0.01M PBS pH7.2±0.2; 0.01M pH7.2 PBST;
试剂名称
1*PBS/L
试剂名称
1*PBST/L
NaH2 PO4
0.23g
1*PBS溶液
1L
Na2 HPO4
1.15g
Tween 20 溶液
0.001L
NaCl
8.5g
用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值
(2) 修复液（可选）：6 H8 O7 •H2 O 0.4g；NaC6 H5 O7 •2H2 O 3g；pH6.0；2 PO4 0.07g；NaCl 7.89g；Na2 HPO4 0.45g；KCl 0.10g；pH7.2-7.4；4 H11 NO3 6.05g；C10 H14 N2 Na2 O8 •2H2 O 0.29g；用稀HCl调至pH8.0；4 H11 NO3 1.21g；C10 H14 N2 Na2 O8 •2H2 O 0.37g；pH9.0。
(3) 封闭液：5%空白山羊血清;
(4) 3%过氧化氢（需新鲜配制，30% H2 O2 与dH2 O体积比1:9）;
(5) 抗体稀释液：1X PBS + 5% 正常血清 + 0.3% Triton™ X-100;
(6) EnVision Systems检测体系, HRP显色系统： HRP RABBIT/MOUSE及配套DAB显色液;
(7) 脱蜡液、无水乙醇（分析纯）、去离子水（dH2 O）、Mayer’s苏木素、中性树胶封片剂。
二、实验步骤
（1）烤片：将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上，将其放入55℃的恒温箱中烤片30分钟；同时将脱蜡液1缸一起放入55℃的恒温箱中；
（2）脱蜡至水：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中,再一起从恒温箱中取出置于常温，5分钟后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中，每缸5分钟；用流水清洗切片5分钟。
注意：流水清洗时水流不能直接对着切片；操作过程中需一直保持切片处于湿润状态。
将切片完全浸入到3%双氧水溶液中，室温，孵育10分钟；完成后流水清洗5分钟。
注意：内源性酶含量高的组织，可以延长灭活时间至15-20分钟；双氧水需新鲜配制，可提前5-10分钟配制3%的双氧水。
（1）方法一，微波热修复：将切片浸入盛有修复液的修复盒中，将抗原修复盒盖斜盖在修复盒上；整体放入微波炉中，高火加热3分钟后停火，微波炉内静置5分钟；再高火加热3分钟后停火，微波炉内静置5分钟；随后中低火加热1分钟后停火，微波炉内静置5分钟，然后将切片连同抗原修复盒拿出缓慢冷却至室温。待修复液温度降至室温后，用缓冲液PBS洗涤3次，每次1min。
（2）方法二，高压热修复：在高压锅中，加入抗原修复液，高火预热；待修复液沸腾后将切片置于其中，并完全浸泡组织，盖好锅盖，扣上压力阀，高火继续加热；待限压阀开始转动喷气后调至中火，同时开始计时2分钟；计时结束后离开热源，自然降压后将高压锅移入冷水中缓慢冷却。待修复液温度降至室温后，用缓冲液PBS洗涤3次，每次1min。
注意：修复液需完全浸没切片上组织；修复过程中严禁打开仪器或中断运行程序；修复完成后避免快速冷却；修复液可根据实验需求自行选用修复液。
（1）封闭：待修复液温度降至室温后，从修复盒中取出切片；用缓冲液PBS清洗切片2次，每次3分钟；去除切片上的缓冲液；在组织切片上滴加5%空白山羊血清封闭液；将切片水平放置在底部呈有水的孵育湿盒中，于37℃恒温孵育30分钟；
（2）一抗孵育：去除封闭液，在组织切片上滴加用缓冲液PBS稀释的一抗，水平放置于孵育湿盒中，于4℃孵育过夜；
（3）复温：将孵育湿盒取出室温复温15-30分钟，去除抗体工作液，用缓冲液PBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液PBS洗涤3次，每次5分钟；
（4）二抗孵育：在组织切片上滴加二抗工作液后水平放置于孵育湿盒中，于37℃恒温孵育1h；
（5）去除切片上的溶液，用缓冲液PBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液PBS洗涤3次，每次5分钟；
（6）显色：显色前5分钟，配置DAB显色工作液，C液:B液体积比1:100，充分混匀；在组织切片上滴加显色工作液，显微镜下密切观察颜色变化情况，通常10-60秒即可得到合适的染色强度；将切片浸入大量dH2O中即可终止显色；
（7）复染、返蓝：将切片浸入Mayer’s苏木素中复染切片，用流水清洗10分钟。
注意：染色过程中需一直保持切片处于湿润状态；染色过程中所有试剂使用过程中均需保证完全覆盖切片上组织。
（1）脱水：将清洗后的切片于无水乙醇中浸泡1次，10秒；高温（55℃-60℃）下完全干燥；
（2）封片：在切片中心滴加适量中性树胶，并加盖盖玻片。
一、实验仪器及试剂
4℃冰箱、恒温恒湿箱、通风橱、移液器、避光孵育湿盒。
(1) 缓冲液：0.01M pH7.2±0.2 TBS ；0.01M pH7.2±0.2 TBST
试剂名称
1*TBS/L
试剂名称
1*TBST/L
Tris
1.21g
1*TBS
1L
NaCl
8.8g
Tween 20 溶液
0.001L
用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值
用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值
(2) 固定液：4%中性甲醛固定液（TBS缓冲液配制）
(3) 抗体稀释液：1X TBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100
(4) 通透剂：0.3% Triton X-100（TBS缓冲液配制）
(5) 二抗（可选）：
(6) 染核试剂：1mg/mL DAPI（用时使用0.01M pH7.2 TBS缓冲液配制）
(7) 去离子水（dH2 O）、抗荧光衰减封片剂。
二、实验步骤
(1) 弃去培养基，在细胞上缓慢加入常温TBS，清洗2次，每次5秒；
(2) 细胞固定：在细胞上覆盖 4%中性甲醛固定液（TBS缓冲液配制），置于4℃，固定15min；固定液需足量；
(3) 固定液的清洗：去除固定液，使用4℃预冷的TBS缓冲液，漂洗3次，每次5分钟；
注意：需避免实验操作时温差过大或温度骤变；固定液需保证足量，可过量使用；甲醛有毒性，加固定液和固定后的清洗需在通风橱内操作。
（1）封闭：用5%空白山羊血清将样本完全覆盖，切片需放置于湿盒内，细胞孔板可直接将孔板密封好，置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min；
（2）一抗孵育：去除封闭液，直接在样本上滴加TBS缓冲液配制的一抗工作液，样本需完全覆盖，切片需放置于湿盒内，细胞孔板可直接将孔板密封好，置于4℃孵育过夜；
（3）复温：将样本置于常温，复温15min，去除抗体工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
（4）二抗孵育：在样本上滴加与一抗种属对应的荧光二抗工作液，样本需完全覆盖，避光，37℃，孵育1小时；去除二抗工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
（5）染核：在样本上滴加DAPI工作液，使用0.01M pH7.2±0.2 TBS缓冲液配制，DAPI溶液：TBS缓冲液体积比1:500，避光，室温，孵育10分钟；去除DAPI工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
（6）细胞孔板可直接加入抗荧光衰减封片剂后，于荧光显微镜下观察并采集图像；细胞涂片滴加抗荧光衰减封片剂，然后加盖盖玻片封片，再于荧光显微镜下观察并采集图像；细胞爬片可取出，盖在滴加抗荧光衰减封片剂的载玻片上后，于荧光显微镜下观察并采集图像。
注意：实验中，所有试剂滴加应准确、快速、足量，不能出现干片的情况；染色步骤从二抗孵育开始，后续所有步骤都需注意避光操作；染色完成后需及时观察并采集图像，避免干燥和荧光物质淬灭。
一、实验仪器及试剂
微波炉、4℃冰箱、恒温恒湿箱、烘箱、移液器、避光孵育湿盒、抗原修复盒。
(1) 缓冲液：0.01M pH7.2±0.2 TBS ；0.01M pH7.2±0.2 TBST
试剂名称
1*TBS/L
试剂名称
1*TBST/L
Tris
1.21g
1*TBS
1L
NaCl
8.8g
Tween 20 溶液
0.001L
用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值
用稀HCl溶液和NaOH溶液调pH值
(2) 修复液（可选）：6 H8 O7 •H2 O 0.4g；NaC6 H5 O7 •2H2 O 3g；pH6.0；2 PO4 0.07g；NaCl 7.89g；Na2 HPO4 0.45g；KCl 0.10g；pH7.2-7.4；4 H11 NO3 6.05g；C10 H14 N2 Na2 O8 •2H2 O 0.29g；用稀HCl调至pH8.0；4 H11 NO3 1.21g；C10 H14 N2 Na2 O8 •2H2 O 0.37g；pH9.0。
(3) 封闭液：5%空白山羊血清
(4) 抗体稀释液：1X TBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100
(5) 二抗：
(6) 染核试剂：1mg/mL DAPI（用时使用0.01M pH7.2±0.2 TBS配制）
(7) 去离子水（dH2 O）、抗荧光衰减封片剂。
二、实验步骤
(1) 烤片：将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上，将其放入55℃的恒温箱中烤片30分钟；同时将脱蜡液1缸一起放入55℃的恒温箱中；
(2) 脱蜡至水：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中,再一起从恒温箱中取出置于常温，5分钟后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中，每缸5分钟；用流水清洗切片5分钟。
注意：流水清洗时水流不能直接对着切片；操作过程中需一直保持切片处于湿润状态。
（1）方法一，微波热修复：将切片浸入盛有修复液的修复盒中，将抗原修复盒盖斜盖在修复盒上；整体放入微波炉中，高火加热3分钟后停火，微波炉内静置5分钟；再高火加热3分钟后停火，微波炉内静置5分钟；随后中低火加热1分钟后停火，微波炉内静置5分钟，然后将切片连同抗原修复盒拿出缓慢冷却至室温。
注意：修复液需完全浸没切片上组织；修复过程中严禁打开微波炉门；修复完成后不可快速冷却；修复液可根据实验需求自行换用其他类型修复液。
（2）方法二，高压热修复：在高压锅中，加入抗原修复液，高火预热；待修复液沸腾后将切片置于其中，并完全浸泡组织，盖好锅盖，扣上压力阀，高火继续加热；待限压阀开始转动喷气后调至中火，同时开始计时2分钟；计时结束后离开热源，自然降压后将高压锅移入冷水中缓慢冷却。待修复液温度降至室温后，用缓冲液洗涤3次，每次1min。
注意：修复液需完全浸没切片上组织；修复过程中严禁打开仪器或中断运行程序；修复液可根据实验需求自行换用其他类型修复液。
（1）封闭：用5%空白山羊血清将样本完全覆盖，切片需放置于湿盒内，置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min；
（2）一抗孵育：去除封闭液，直接在样本上滴加TBS缓冲液配制的一抗工作液，样本需完全覆盖，切片需放置于湿盒内，置于4℃孵育过夜；
（3）复温：将样本置于常温，复温15min，去除抗体工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
（4）二抗孵育：在样本上滴加与一抗种属对应的荧光二抗工作液，样本需完全覆盖，避光，37℃，孵育1小时；去除二抗工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
（5）染核：在样本上滴加DAPI工作液，使用0.01M pH7.2 TBS缓冲液配制，DAPI溶液：0.01M pH7.2 TBS缓冲液体积比1:500，避光，室温，孵育10分钟；去除DAPI工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；
（6）滴加抗荧光衰减封片剂，然后加盖盖玻片封片，再于荧光显微镜下观察并采集图像。
注意：实验中，所有试剂滴加应准确、快速、足量，不能出现干片的情况；染色步骤从二抗孵育开始，后续所有步骤都需注意避光操作；染色完成后需及时观察并采集图像，避免干燥和荧光物质淬灭。
一、实验试剂
（1）rProtein A/G Plus MagPoly Beads
（2）裂解液&洗杂液：Cell lysis buffer for IP (without inhibitors)
（3）蛋白酶抑制剂
（4）封闭液：含 3% BSA 的 1X PBS
（5）1×PBS 缓冲液
（6）5×loding buffer（使用时用去离子水稀释至工作浓度即可）
（7）Control IgG （AC005/ AC011/AC034）
二、实验步骤
（1）贴壁培养细胞
a. 取裂解液室温溶解混匀，根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。
b. 去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养基清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。
c. 按照6孔板每孔加入100~200μl裂解液的比例，加入裂解液。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液作用于细胞1~5s内，细胞会被裂解。
d. 1000~12000g，离心3~5min（如果用冷冻离心机4℃效果更佳），取上清。
（2）悬浮培养细胞
a. 取裂解液室温溶解混匀，根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。
b. 速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。
c. 手指轻弹细胞，使其松散。按照6孔板每孔加入100~200μl裂解液的比例，加入NP-40裂解液。通常6孔板每孔加入100~200μl裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量150~200μl，再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应无明显沉淀。
d. 1000~12000g，离心3~5min（如果用冷冻离心机4℃效果更佳），取上清。
（3）组织样本
a. 取裂解液室温溶解混匀，根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂。
b. 把组织剪切成细小的碎片，越小越好。
c. 取液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1~2min之内，以减少蛋白的降解。
d. 按照每20mg组织加入100~200μl裂解液的比例，加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解30-60min。（步骤3、4也可采用以下过程：按照每20mg组织加入100~200μl裂解液的比例加入NP-40裂解液。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，过程尽量控制在1~2min之内，以减少蛋白的降解。）
e. 按照每20mg组织加入100~200μl裂解液的比例，加入裂解液。
f. 1000~12000g，4℃离心10~15min（如无低温离心机，室温下离心也可），取上清。
（1）将rProtein A/G Plus MaqPoly Beads颠倒或漩涡混匀，翻转瓶身发现底部无黑色沉淀即可。
（2）取30μl rProtein A/G Plus MaqPoly Beads至新的EP管中，放在磁分离器上，待溶液澄清后，用移液器吸弃保护液。
（3）将EP管从磁分离器上取下来，加入1ml Cell lysis buffer for IP (without inhibitors)，混匀，放置在磁分离器上，收集磁珠，用移液器吸弃洗杂液，重复2次。
（4）将EP管从磁分离器上取下来，加入1mL的3% BSA，置于翻转混合仪4℃封闭1h.
（5）重复步骤3），备用。
（1）将含有抗原的样品（通常300μl-1000μl，总蛋白量200μg）中加入目标抗体（通常3μg），置于翻转混合仪4℃下反应2h或过夜。
（2）将上述完成抗体-抗原结合的复合物与备用好的磁珠进行混合，置于4℃下反应2h或过夜。
（3）将上述磁珠-抗体-抗原复合物放在磁分离器上进行分离，收集上清液，以备后续检测。
（4）向离心管中加入1ml洗杂液，用移液器轻轻吹打使磁珠-抗体-抗原复合物均匀分散，然后进行磁性分离，弃上清液；从磁分离器上取下离心管，重复洗涤两次。
（1）变性洗脱(此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。)
a. 从磁分离器上取下离心管，向其中加入30μl 2X SDS-PAGE Loading Buffer混合均匀，95℃加热15min。
b. 置于磁性分离器上进行磁性分离，收集上清液进行SDS-PAGE检测。
（2）非变性洗脱
a. 向磁珠-抗体-抗原复合物中加入50μl洗脱液，混合均匀，室温孵育5min。
b. 置于磁性分离器上进行磁性分离，收集洗脱液至新的EP管中。
c. 重复步骤1）和2），收集洗脱液，与2）中洗脱液混合，加入中和液中和至pH7.0-8.0。用于后期功能分析。
一、实验试剂
（1）PBS缓冲液
（2）TE 缓冲液
（3）甲醛:40%
（4）甘氨酸:20%
（5）Lysis Buffer
（6）Dilution buffer
（7）Wash buffer I
（8）Wash buffer II
（9）Wash buffer III
（10）Elution buffer
（11）rProtein A/G Plus MagPoly Beads
二、实验步骤
（1）取1x107 细胞，加入1ml PBS和25ul甲醛（40%）混匀后，于冰上放置10min（混匀2-3次）。
（2）加入50ul甘氨酸（20%）,混匀后静置5min。
（3）3000rpm离心5min,用1ml PBS清洗2遍。
（4）加入200ul Lysis Buffer（含10ul蛋白酶抑制剂），置于旋转摇床4℃裂解30min。
（5）加入800ul Dilution buffer,混匀后超声15-20min。
（6）12000rpm离心10min取上清，吸取少量裂解液DNA回收检测。
（7）琼脂糖电泳检测DNA打断程度，DNA长度应在150-900 bp之间。
（8）使用Qubit™荧光定量仪检测染色质浓度。
注意：整个过程在低温下进行，超声条件根据检测结果进行调整。
（1）取60ul 磁珠加入1ml BSA(1mg/ml,TE缓冲液配制)，于旋转摇床4℃旋转5min,至于磁力架弃去液体，加入1ml BSA重复此操作1次。
（2）加入1ml TE溶液清洗磁珠两次，于4℃放置备用。
（3）取180ul染色质裂解液,加入320ul Dilution buffer（一份IP样品）, 分别加入5ul抗体，1ul Normal Rabbit IgG，5ul Histone H3于4℃过夜，然后加入60ul处理好的磁珠，4℃孵育2h。
（4）依次使用Wash buffer I/II/III 洗涤磁珠，完成后使用TE溶液洗涤两次。
（5）弃去上清后加入200ul Elution buffer,置于旋转摇床室温旋转10min。
（6）吸取上清加入10ul蛋白酶K,65℃水浴至少4h。
（7）使用DNA回收试剂盒回收DNA。
注意：每份IP样本应含DNA的量为7-10ug DNA(转录因子15-20ug)，抗体加入量为3-5ug,可根据实验进行优化。
（1）反应体系 (20ul)
DNA模板：
5 μl
引物：
5 μl
Green Master Mix:
10 μl
（2）反应体系 (20ul)
Stage 1
预变性
Reps: 1
95 ℃
5 min
Stage 2
循环反应 b
Reps: 40
95 ℃
10 sec
60 ℃
30 sec
Stage 3
融解曲线
Reps: 1
95 ℃
15 sec
60 ℃
60 sec
95 ℃
15 sec
假设 Input 起始浓度为 a，Ct1 个循环数扩增后达到阈值；IgG 起始浓度为 b，Ct2 个循环数扩增后达到阈值；目的蛋白起始浓度为 c，Ct3 个循环数扩增后达到阈值。则可以得到如下公式：
a×2Ct1 = b×2Ct2 = c×2Ct3
b/a = 2Ct1 /2Ct2 = 2（Ct1-Ct2）
b：a=2（Ct1-Ct2）
c/a = 2Ct1 /2Ct3 = 2（Ct1-Ct3）
c：a=2（Ct1-Ct3）
检测结果=2（Ct1-Ct3） /2（Ct1-Ct2）
1. 细胞计数：将培养好的细胞收集于50 mL离心管中并计数；500 g离心4 min，去上清；
2. 制备单细胞悬液：将收集的细胞用 1mL 0.5% BSA/PBS溶液重悬，400 g离心3 min，去上清，重复2次；用 0.5% BSA/PBS溶液重悬细胞，分配到96孔板中，每孔50 μL细胞悬液；
3. 一抗孵育：每孔加入一抗稀释液50 μL。振荡，室温反应20 min；
4. 洗涤：400 g离心5 min，去上清；
5. 二抗孵育：如非荧光染料直标抗体加入100 μL 荧光二抗 ，重悬避光振荡，室温反应20 min；直标荧光抗体直接跳转到步骤8；
6. 以 400 g 的速度离心 5 分钟，去上清；
7. 洗涤：加入200 μL 0.5% BSA/PBS重悬，400 g离心5 min，去上清，重复两遍；
8. 用200 μL 0.5% BSA/PBS重悬细胞，上机分析。
1. 将培养好的细胞收集于50 mL离心管中并计数；500 g离心4 min，去上清；
2. 将收集的细胞用1mL 0.5% BSA/PBS溶液重悬，400 g离心3 min，弃上清，用 0.5% BSA/PBS溶液重悬细胞，按设计方案对应96孔板中每孔加100 μL细胞悬液，离心，去上清；
3. Live/Dead (Zombie NIR)染色，L/D staining solution 用1×PBS按1:1500的比例稀释，按设计将L/D staining solution分配到96孔V型板里，每孔100 μL，重悬每孔中的细胞，混合，避光室温孵育15 min；
4. 400 g离心5 min，弃上清，用FACS buffer洗2次，按设计将1X Intracellular Fixation buffer分配到96孔V型板里，每孔100μL，重悬每孔中的细胞，混合 ，避光室温孵育30min；
5. 400 g离心5 min，弃上清，用1X Permeablization buffer洗2次，按设计将用1X Perm buffer稀释好的一抗分配到96孔V型板里,每孔100μL，重悬每孔中的细胞，混合，避光室温孵育30 min；
6. 400 g离心5 min，去上清，用1X Permeablization buffer洗2次；
7. 按设计将用1X Permeablization buffer 稀释好的荧光二抗分配到96孔V型板里，每孔100μL，重悬每孔中的细胞，混合，避光室温孵育30 min；直标荧光抗体直接跳转到步骤9；
8. 400 g离心5 min，去上清，用1X Permeablization buffer洗2次；
9. 用200μL FACS buffer重悬细胞，上机分析。
AYP17616
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